制备芋螺毒素的方法主要有三种方法。第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且由于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此靠分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产并不现实，但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化。由于部分芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题，且芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰凳薯胺化酶基因，可望生产出大量廉价的重组芋螺毒素。 从芋螺的毒管中可提取少量天然芋螺毒素，大多从野生芋螺的死体毒管中提取。或者引诱活体芋螺刺捕猎物，用乳胶套收集喷射的毒液，可收集到几微升毒液。为了充足供应芋螺，美国研究人员在农场里尝试芋螺的养殖，只养了Conuspurpurascens一种，但还不能辨别活芋螺的性别，也未观察到芋螺的交配行为，这说明暂时无法人工繁殖芋螺。因而，靠从芋螺体内分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产是不现实的，天然来源的芋螺毒素十分有限仔斗，这制约了芋螺毒素研究的开展和应用。但获得的少量天然毒液可用高效液相色谱仪进行分离和分析，通过质谱仪和序列分析，可得到单个毒素肽的氨基酸序列。
研究中使用的芋螺毒大多数是毒液排出管抽提物。对于大多数芋螺种来说，这些抽提物勉强用于研究。但也有例外，如一种产自东太平洋猎食鱼的种类称为紫纹芋螺（C.purpurascens），其抽提物量不足以用于生化研究。可以先将紫纹芋螺饲养在水中洞穴中，用吹胀的塑料套子在金鱼身上摩擦，芋螺从沙子中跑出来，吸吮着套子，随套子浮在水面上。或Eppendorf试管，挖去盖子，放一些鱼鳍在试管中，再在鱼鳍上面放上一层薄膜，芋螺试图吸吮试管，便将毒液排入试管中。每收集3-5mL毒液需要耐心地多次用这种方法不停地累积。 芋螺毒素是基因直接表达的产物，现代基因工程技术也促进了芋螺毒素的研究与开发。在研究芋螺毒素基因的结构和生物合成过程，寻找新芋螺毒素基因，研究其分子遗传学机制，蛋白质折叠机制方面有重要的应用，且已取得了较快的进展。构建芋螺毒素cDNA文库，从中筛选新芋螺毒素基因已成为研究新芋螺毒素及其分子特征的重要途径之一。
芋螺毒素在体内先合成较大的无活性多肽前体，它们由50~80个氨基酸残基组成，含有典型的信号肽序列区和可变枣戚者区，在近成熟肽区位置，有标准的蛋白质水解信号，这些信号肽序列在所有超家族成员中具有保守性。同一超家族的芋螺毒素成员具有高度保守的信号肽序列和高度保守的二硫键连接方式。如MVIIC，MVIID，SⅥA，SⅥB和SO3是根据已知ω-毒素毒素肽氨基酸保守序列，合成特定的探针，从中筛选出来的。其他国家已构建了织锦芋螺（C.textile），幻芋螺（C.magus），地纹芋螺（C.geographus），金翎芋螺（C.penaceus）等几种芋螺的cDNA文库。同时根据信号肽及3’端非翻译序列，设计芋螺毒素各个超家族基因的特异PCR引物，从cDNA和基因组DNA中克隆新型毒素基因成为可能，且是分离芋螺毒素基因的主要方法。
研究人员从3种芋螺（C. livi-dus、C.abbreviatus和C.ebraeus）中测出了284个四环芋螺毒素前体蛋白基因序列，又从另外5种芋螺（C. arena-tus，C.pennaceus，C. tessulatus，C.ven-tricosus和C. textile）中获得了170个芋螺毒素的cDNA序列。他们都在GeneBank中申请了序列号。中国海南浅纹芋螺（C.striatus）和织锦芋螺（C. textile）中也分别发现了6种新O-超家族毒素的cDNA序列和2种α-CTX。地纹芋螺（C.geographus）基因组DNA则用PCR法克隆到新型α-CTX GIC。
中国海南产的大理石芋螺（Conus marmoreus Linnaeus）、幻芋螺（Conus magus Linnae-us）、信号芋螺（Conus litteratus Linnaeus）、勇士芋螺（Conus miles Linnaeus）、独特芋螺（Conus caracteristicusFischer）、织锦芋螺（Conus textileLinnaeus）、桶形芋螺（ConusbetulinusLinnaeus）、疣缟芋螺（Conus livi-dusHwass）等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素肽及其基因。根据毒素基因推测出相应的毒素氨基酸序列，通过人工合成或基因体外重组表达出这些芋螺毒素，进一步研究其活性，这些毒素即是新药开发的候选药物和先导药物。但部分ω-芋螺毒素的N端为Cys，C端酰胺化，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决C-端酰胺化问题，且ω-芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象。 采用人工化学合成的方法，即通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素，较多使用的是多肽固相合成法。与传统的多肽液相合成法相比，该法具有如下优越性：只需经过过滤和冲洗，就可以将产物多肽从可溶性试剂中分离开来；易于使用自动化设备；过量的反应试剂促使反应彻底进行；反应产物多肽一直结合在固相载体上，损失量将达到最小。根据氨基端保护基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法为Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反应条件温和、副反应少等特点，大多芋螺毒素的合成都采用该方法。合成后将肽链从树脂上裂解下来，常用的裂解剂为reagentK试剂（trifluoroaceticacid∶water∶ethanedithiol∶phenol∶thioanisole，90∶5∶2.5∶7.5∶5）。接着脱去侧链保护基、复性、纯化，即可得到与天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物进行结构和功能的研究。但由于ω-芋螺毒素氨基酸残基较多，一般都在25个以上，其人工合成的产率较小，纯度也低，合成的肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。氧化折叠的方法有空气氧化法、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧化法等。
研究人员在合成ω- CNVIIA时，对这几种氧化折叠方法作了比较，发现gluthatione氧化法效果最好。随后进行纯化，即可得到具有天然毒素活性且纯度较高的多肽，最后利用NMR技术进行构象分析。因此，人工合成芋螺毒素的成本较高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。但由于芋螺毒素药物的用量小，效果好，价值高，可部分满足市场需求。 随着对芋螺毒素研究的深入和多肽合成技术的进步，芋螺毒素的合成方法也不断改进。Ale-wood小组将硒代半胱氨酸引入，合成了3个α-芋螺毒素ImI的类似物。具体操作是用硒代半胱氨酸代替了其中的1对或者2对半胱氨酸，形成二硒键替代了原有的二硫键，显著提高了芋螺毒素的氧化折叠效率，NMR和CD谱都表明类似物和天然的ImI在结构上十分相似，并且保持了原有的生物活性。可采用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸合成了μ-芋螺毒素SIIIA类似物，并且使用同位素标记了1对半胱氨酸，在提高了合成效率的同时确定了二硫键的连接。
有研究人员在利用微波合成法合成了α-芋螺毒素MII的过程中，比较了使用微波合成法和经典的固相合成法。结果表明使用微波合成的产率更高，从77%~89%提高到75%-93%。更重要的是使用微波加热缩短了每个反应周期的时间，由1-2h减少到12-15 min。如果把微波用于环状肽α-芋螺毒素IMI合成，合成效率也有所提高。此外，芋螺毒素的合成还有很多其它的策略，如μ-MrIA和α-MII采用N-C骨架环化的方法合成。还有科学家利用内酰胺、硫醚等代替二硫键，研究芋螺毒素的折叠产率。 芋螺毒素的化学合成是获得芋螺毒素的重要方法，也是进一步研究芋螺毒素活性与结构的基础。关于芋螺毒素线性肽的合成研究已较深入，合成过程中最主要的问题是二硫键如何正确连接。针对不同的芋螺毒素合成，一般是在原有研究基础上，进一步摸索适宜的保护基团和折叠方法。在线性肽的合成过程中，应优化反应试剂，减少副产物的形成，缩短反应时间，提高合成效率。
自从20世纪80年代中期合成α-芋螺毒素GI和MI以及ω-芋螺毒素GVIA以来，有数百种芋螺毒素肽都通过多肽固相合成法（solidphase peptide synthesis，简称SPPS）合成。方向是从C端到N端。每一个氨基酸连接由以下几个过程组成：首先是去保护，即保护氨基酸必须用一种碱性溶剂去除氨基的保护基团；其次是氨基酸活化，即下一个连接的氨基酸羧基被一种活化剂所活化；最后是偶联，活化的单体和游离的氨基反应，形成肽键。以上3步循环进行，直至所需的肽合成完毕。
在合成过程中，氨基酸保护基团对合成有着重要影响，特别是一些易于氧化的氨基酸，如Met，Trp等，选择适宜的保护基团可以减少副反应发生。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，所以在合成时半胱氨酸保护基团需要慎重考虑。在固相合成中，半胱氨酸有10种以上的保护基团供选择。这些保护基团对酸碱或金属离子的稳定性不同，可以根据这一特点脱去保护基团，从而可以形成游离的巯基、硫醇盐或者直接脱去保护基团且同时形成二硫键，在这个过程中，切割液起着决定性作用。S-Trt、S-Tmob、S-Xan是芋螺毒素合成中常用的半胱氨酸保护基团，对酸不稳定，因此可与其它的保护基团一起用TFA等切割液脱去形成游离的巯基。S-Acm对酸很稳定，可用于Boc或Fmoc合成中，一般用I2或者Tl（tfa）3直接脱去并同时形成二硫键，也可以在汞盐的条件下脱去并形成游离的巯基，这时要注意His，Met，Trp或者Tyr，它们都有可能被氧化。在Boc合成中，最常用的保护基团是S-MeBzl和S-MeOBzl，它们都对TFA很稳定，但可以用HF脱去。若S-Fm用作半胱氨酸的保护基团，就能先于树脂被脱除。适宜的氨基酸保护基团可以减少合成过程中的副反应，提高合成效率。
由于天然芋螺毒素含有特定的二硫键连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也是限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。在芋螺毒素合成过程中，二硫键形成一般通过以下两种方法：第1种为游离的巯基形成二硫键；第2种为半胱氨酸脱保护直接形成二硫键；，因芋螺毒素一般含有多对二硫键，一般情况下需综合使用上述两种方法。游离的巯基形成二硫键在芋螺毒素的合成过程中，半胱氨酸的保护基团如果是S-Trt、S-Tmob、S-Xan等，经过切割后就会形成游离的巯基，这些巯基需进一步自由氧化形成二硫键。这是芋螺毒素合成最常用的策略。游离的巯基形成二硫键的方法有多种，如空气氧化法、二甲基亚砜氧化法、固相埃尔曼试剂法、铁氰化钾氧化法等。一般认为此法形成的终产物受热力学控制，反应产物为水，纯化步骤少。但由于芋螺毒素含多个半胱氨酸，自由氧化后会形成多种同分异构体。含两对二硫键可以形成3种异构体，如α、ρ、τ、χ等家族芋螺毒素。如果含有6个半胱氨酸理论上会形成15种异构体。研究者已经摸索多种方法，研究体外条件下二硫键形成的机制。结果表明芋螺毒素本身的性质和外界因素都对二硫键的连接有着一定程度的影响。如Shigeiu等研究了盐浓度和温度对ω-芋螺毒素MVIIC折叠的影响。结果显示在5℃时氧化的效果最好，天然构象的产率随着温度的上升而下降，而2.0mol·L-1（NH4）2SO4可以大大提高ω-芋螺毒素MVIIC的正确折叠效率。Cruz等研究了去污剂对疏水性δ-芋螺毒素PVIA氧化折叠的影响，结果表明加入去污剂后天然产物的比例大大提高。Miloslavina等研究了离子化溶液对芋螺毒素折叠的影响，结果表明离子化溶液可以提高亲水性和疏水性肽的氧化折叠效率。此外，前体肽和二硫键异构酶作用以及酰胺化等对芋螺毒素二硫键形成也都有一定程度的影响。半胱氨酸脱保护定点形成二硫键芋螺毒素含有多对半胱氨酸，每一对半胱氨酸可以采用不同的基团保护，合适的脱保护试剂脱去保护基团，定点形成二硫键，这是形成芋螺毒素二硫键正确连接的常用方法之一，此法可以定点形成二硫键，为构象研究提供了方便，但也需要注意Met、Trp等这些敏感的氨基酸可能会发生副反应。含有2对二硫键的α-芋螺毒素GI即采用此种方法被合成，其半胱氨酸分别用Acm和MeBzl保护，用HF/anisole脱去MeBzl保护基团，铁氰化钾氧化形成第1对二硫键，然后利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，合成α-芋螺毒素GI时，在脱去MeBzl的同时，树脂也被切割。而Alewood等对定点合成α-芋螺毒素GI进行了进一步探索，即首先在树脂上形成二硫键，最后切去树脂，具体为先用巯基乙醇/DIEA/DMF脱去Fm保护基团形成第1对二硫键，之后再利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，最后才使用HF脱去树脂。
另外，还有一种新的定点形成二硫键的方法，称为一罐法（One-pot method）。即两对半胱氨酸分别用t-Butyl和4-methylbenzol基团保护，在5%DMSO/TFA和25℃条件下，t-Butyl保护基团被脱除，再将温度升高到70℃脱去4-methylbenzol基团。研究人员利用两步法和一罐法均合成了α-芋螺毒素ImI，并且比较二者合成效率，结果表明一罐法合成效率更高。
O-、M-等超家族芋螺毒素比较特殊，因为含有3对二硫键，一般自由氧化和定点形成二硫键相结合来合成。如ω-芋螺毒素MVIID，此肽含有6个半胱氨酸。首先用S-Trt保护Cys1，Cys3，Cys4，Cys6，Cys2，Cys5用S-Acm保护。先用切割液脱去树脂和S-Trt保护基团，形成4个游离的巯基，空气氧化形成2对二硫键，剩下的1对保护基团采用I2脱去并形成第3对二硫键。含有3对二硫键的芋螺毒素还可以采用三步法合成，即每一步都形成1对二硫键。Durieux等利用S-Trt，S-Acm和S-MeOzl3种保护基团，分3步切割形成二硫键合成了ω-芋螺毒素MVIIA。
